在色譜儀器微型化過程中，尺寸的縮小不僅要考慮材料的性質(zhì)和制造上的可能，還要從原理上考慮尺寸縮小后所帶來的一系列問題。這些問題包括:

　　(1)分離系統(tǒng)中被分配的分子個數(shù)是否大于106，因為只有大于106才能得到符合統(tǒng)計結(jié)果的數(shù)據(jù);

　　(2)因分離通道尺寸縮小，自然提高了單位柱長的效率，但是總長度的減少可能使總分離效能遠低于常規(guī)儀器;

　　(3)對于質(zhì)量敏感型檢測器，經(jīng)過分離柱后單位時間內(nèi)到達檢測器的分子個數(shù)是否滿足檢測原理所要求的最小數(shù)目;

　　(4)對于濃度型檢測器，到達檢測池的分子數(shù)目是否能滿足符合統(tǒng)計規(guī)律的分子數(shù)目;

　　(5)檢測微區(qū)內(nèi)的外加能量密度是否超過被檢測分子所能承受的極限;

　　(6)微量流動相的輸送與控制;

　　(7)因材料尺寸的縮小，表面層氧化或腐蝕對器件功能的影響。最后，色譜儀器微型化所帶來的好處不僅僅是單位長度分離效率的提高，而是總分離能力的保持甚至提高;不僅僅是分離系統(tǒng)或某個部件的微型化，而是整體的微型化;不僅僅是質(zhì)量靈敏度的提高，而是濃度靈敏度的保持或提高;不僅僅是能量和物質(zhì)的低消耗，而是使用的方便和友好;不僅僅是整體尺寸的縮小，更重要的是整機的穩(wěn)定性和可靠性的提高!

　　下面分別討論上述7個問題。

　　(1)色譜分離的基本原理是有符合統(tǒng)計規(guī)律數(shù)目的分子群經(jīng)過不斷的兩相分配和分子碰撞，利用其分配系數(shù)的差異來達到分離的目的。這是一個宏觀參數(shù)。當分子數(shù)目低于這個數(shù)目時，就會偏離統(tǒng)計規(guī)律而出現(xiàn)所謂的漲落現(xiàn)象。分子數(shù)目越少，漲落現(xiàn)象越嚴重。當分子數(shù)目低于103個時，已沒有準確的色譜保留規(guī)律，因此也就失去了宏觀意義下的分離規(guī)律。一般地，保證符合統(tǒng)計規(guī)律的分子數(shù)目是106個。

　　例如內(nèi)徑30μm的填充毛細管液相色譜(μ2HPLC)柱或毛細管電泳柱，若分別保持10萬/m和40萬/m的分離柱效，直接進樣時不過載的進樣量分別為40pL(1pL=10-12L)和115pL，分子總數(shù)分別是112×1012～112×1014和415×1010～415×1012。樣品中含量低至1～0.01μL/L(對μ2HPLC)或低至20～0.2μL/L(對CE)的組分就不能滿足106個分子的數(shù)目要求，分離過程中就會出現(xiàn)上述問題。所以，上述分離系統(tǒng)對濃度高于這個指標的樣品分離時可以有重復的保留時間。如果考慮檢測方面的限制[參見下述的(3)和(4)>，痕量分析中用粗內(nèi)徑的填充色譜柱總是優(yōu)于微型色譜柱。

　　為了能進行痕量分析，微型分離分析系統(tǒng)往往采用樣品預濃縮技術(shù)以補償濃度靈敏度的不足。但為此而發(fā)展的技術(shù)也同樣適用于常規(guī)分離分析系統(tǒng)，同樣可以提高常規(guī)儀器的靈敏度，除非樣品量受到嚴格限制。

　　(2)45年前的色譜柱理論已經(jīng)指出，毛細管開口柱的內(nèi)徑越小，或填充柱的填料粒度越小，色譜柱的分離效率就越高。毛細管電泳亦然，只是理論上有些不同，如有散熱問題和塞子流型的特點。微型化中普遍采用的細內(nèi)徑分離柱并不是微型儀器的專利，所能達到的高柱效也不是最近才認識到的。如果在現(xiàn)有常規(guī)儀器中使用這種等效內(nèi)徑的色譜柱，再適當改進進樣技術(shù)和檢測器，就會有與微型色譜或芯片電泳同樣的單位柱長的柱效，同時還可以有極高的總分離效能，因為常規(guī)儀器中分離柱的長度很少受限，而高的分離效能才是真正有意義的。所以，微型色譜和芯片毛細管電泳用短分離柱而有快速分離的特點，并不是它真正的優(yōu)點，因為用同樣尺寸的分離柱可以分別在常規(guī)色譜和毛細管電泳上實現(xiàn)同樣的效果。用現(xiàn)有的思維模式來進行的色譜儀器微型化，導致了使用短分離柱，而且所有的應用例子都是用極簡單的樣品，這是因為這樣的微型化儀器的總分離效能太低。

　　(3)質(zhì)量型檢測器的響應值與單位時間內(nèi)進入檢測器的樣品分子數(shù)成正比。分離柱的樣品容量與柱內(nèi)徑的3次方(毛細管開口柱)或平方(填充柱)成正比。例如氣相色譜FID檢測器，用內(nèi)徑50μm的毛細管柱只能分析樣品中含量為011%(1000ppm)以上的組分;而用內(nèi)徑530μm的毛細管柱能分析樣品中含量為3×10-7(013ppm)以上濃度的組分，相差3000倍。雖然細內(nèi)徑色譜柱的譜帶寬度(表現(xiàn)為色譜峰寬度)比粗內(nèi)徑色譜柱的窄，能增加單位時間內(nèi)的分子數(shù)目，但它是與柱徑的平方根(本質(zhì)上是柱效的平方根關系)成正比;與柱容量的減少比，仍然虧215次方。離子化檢測器和熒光檢測器都是質(zhì)量型的，離子化效率一般在10-5～10-3，熒光產(chǎn)率一般在10-3，所以單位時間內(nèi)進入檢測器的分子數(shù)目必須大于50×103～50×105，具體數(shù)值取決于檢測器的性能。用濃度型檢測器會極大地改善這種 狀況，因為響應值主要與目標組分的濃度有關，特殊的質(zhì)量型檢測器，如具有單分子檢測能力的激光誘導熒光檢測器和熱透鏡檢測器等，已用于CE和μ2HPLC。但是他們絕對不是微型化的設備，也不是一臺色譜儀或電泳儀的價格所能買到的。在痕量分析中，用直接進樣方式和質(zhì)量型檢測器時，常規(guī)色譜總是優(yōu)于微型色譜。

　　(4)從宏觀上講，濃度型檢測器的響應值與進入檢測池內(nèi)樣品分子的總數(shù)無關，而只與樣品分子和流動相分子數(shù)的比值有關。例如，用50μm和530μm內(nèi)徑的毛細管柱和池體積為012μL的熱導檢測器(μ2TCD)檢測，最小檢出濃度分別為2×10-5(體積分數(shù))和2×10-6(體積分數(shù))，僅差10倍。而后者單位時間內(nèi)進入檢測池中的分子數(shù)目比前者多3×103倍。所以微型色譜和微型流動分析儀器中用濃度型檢測器有利。但是這個理論是有限度的。如在CE和μ2HPLC中，當分離柱內(nèi)徑≤75μm、塔板高度≤10μm時，要求檢測池體積在nL級(10-8～10-9L)，用吸收光譜檢測器(濃度型檢測器)時，上述理論不再成立。因為從微觀看，檢測的原理是利用樣品分子的某種特性，當分子數(shù)目不滿足檢測原理所要求的統(tǒng)計數(shù)目時，表現(xiàn)為噪聲信號。所以在上述的微型分離系統(tǒng)中，最小檢出濃度是很高的，遠不如常規(guī)分離系統(tǒng)的低。

　　就檢測器本身而言，微型化會影響它的響應靈敏度。如氣相色譜用的熱導檢測器，由于給定氣體的熱導率與通道的壁間距(d)有關，特別是在d≤015mm時，熱導率隨d的減小而呈幾何增加，因此微型化使熱導檢測器的靈敏度有大幅度提高。所以，微型化研究應選擇那些在原理上有利于保持或提高靈敏度的檢測器，或者研究那些有極高檢測靈敏度的檢測器微型化問題，如激光誘導熒光檢測器。

　　(5)檢測微區(qū)內(nèi)的外加能量問題。任何檢測原理和技術(shù)都是依賴樣品分子與外加能量的相互作用而產(chǎn)生的物理信號。由于檢測微區(qū)達到μm級，而作用到微區(qū)的光或電磁波強度往往比常規(guī)檢測器高幾倍到幾萬倍，以此彌補因樣品分子數(shù)減少而損失的信號2噪聲比值。例如，吸收光譜檢測器或熒光光譜檢測器等常規(guī)檢測器的光斑直徑在500～1000μm，而μ2HPLC或μ2CE的檢測器光斑直徑僅有30μm，甚至5μm，但所用的光源功率往往是相同的，經(jīng)過聚焦，達到檢測區(qū)的光強度提高了3個數(shù)量級甚至更高。在這樣小的微區(qū)內(nèi)，如此高的光強度會產(chǎn)生如下問題:液體汽化、熒光物質(zhì)“漂白”、被檢測分子變性、響應非線性等。

　　(6)微量流動相的輸送與控制。在儀器的微型化中，因為氣相色譜的載氣流量以10mL/min到011mL/min計，液相色譜流動相流量以50μL/min到0105μL/min計。特別是液相色譜儀的微流量輸液泵，更是微型化的關鍵難題。用分流的方法解決用常規(guī)裝置實現(xiàn)微流量調(diào)控只是權(quán)宜之計;同樣，通過改裝常規(guī)檢測器來適應微型儀器也是很牽強的。例如，由于動態(tài)密封的微滲漏，現(xiàn)有的機械/電子式氣體流量控制閥幾乎不能對1mL/min的流量有1%的控制精度;現(xiàn)有的液相高壓輸液系統(tǒng)也不能對015μL/min的流量有3%的控制精度。而上述精度都是微型色譜儀所需要的。所以，只有從原理上、材料上、技術(shù)工藝上和工程上都重新研究和設計，才能有真正意義上的微型化。

　　(7)因所用材料質(zhì)量的微小，表面層氧化或腐蝕對器件功能的影響遠大于常規(guī)色譜儀器。例如熱導檢測器(TCD)中的敏感熱絲，常規(guī)的直徑在100μm，而微型化的熱敏層厚度僅有幾個μm甚至1μm，所以必須解決熱敏層老化或腐蝕的難題。再比如微型化的電化學檢測器，電極厚度在10-1μm量級，而常規(guī)的在102μm量級，兩者相差幾百倍。所以，微型化的器件必須解決耐腐蝕和老化問題，才能成為實用化的器件，而不僅僅是展品或樣機。

　　此外，對于二維分離系統(tǒng)，分離效率決不是簡單的第1根柱效(N1)×第2根柱效(N2)，而是與柱的選擇性有直接關系。當某一對組分在其中一維上不能達到徹底分離時，往往在另一維上的分離度也為零。所以真正有意義的二維分離系統(tǒng)必須是:同系列化合物的目標組分對必須在某一維上達到徹底分離，而不同維擔當分離不同族化合物的任務。

　　在設計構(gòu)思上，微型化不僅是簡單尺寸的縮小，其本質(zhì)上的進步是在解決原理性難題的過程中不斷的創(chuàng)新。

　　不論從科學上還是實用上，片面追求分離系統(tǒng)的微小化而忽視檢測靈敏度和檢測濃度范圍的問題;追求單位柱長分離效率的提高和快速檢測而忽視實際樣品分離對總柱效的要求;追求進樣區(qū)和分離柱的微小化而忽視其可操作性和檢測設備的微型化，是目前微型化研究的誤區(qū)。從戰(zhàn)略上講，整體微型化的難點問題是分析化學微型化發(fā)展的基本難題，雖然有時解決這些問題不是分析化學學科領域的事，但是因為其他學科沒有遇到這類問題，致使這些問題成為游離于所有學科的、但是又需要多學科交叉才能解決的科學和技術(shù)難題。所以，微型化不是簡單的分析化學問題，而是分析化學與材料學、流體力學、電磁學、微加工技術(shù)和工藝、電子學、生化和有機化學等學科的交叉，是能夠在本質(zhì)上推動分析化學發(fā)展的年輕的學科。